玻璃層析柱 色層分析離子交換過濾柱

一、 原理：  有些高分子物質(zhì)含有一些可以分離的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的離子產(chǎn)生交換反應(yīng)。如：      R-SO3H＋M+ ———— R-S3M＋H+      或R-NH3OH＋CL－ ————— R-NH3CL＋OH－      這類高分子物質(zhì)通稱離子交換劑，其中使用普遍的是離子交換樹脂。由于一定的離子交換劑對不同離子的親和力不同，因此在洗提過程中，不同的離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后得到分離。  二、 目的與要求：      本實驗是采用Zerolit225型陽離子交換樹脂所裝的柱，選以特定的PH緩沖洗脫液來分離含有兩個性質(zhì)不同的氨基酸溶液。通過實驗要求掌握裝柱、上樣、洗脫、收集等離子交換柱層析技術(shù)的要點。  三、儀器與裝置：      玻璃層析柱：長19cm，內(nèi)徑1.2cm，3# 砂芯。      HL-2型恒流泵。      HD-4型電腦核酸蛋白檢測儀。      BS-100A自動部份收集器。      250ml燒杯。      1ml吸管。      水浴鍋。      72型（或721型）分光光度計。  四、 試劑與藥品：      樹脂：Zerolit225型陽離子交換樹脂。      洗脫液：0.45N，PH5.3檸檬酸緩沖液，取285g檸檬酸（C6O7H8•H2O）；186g 97℅NaOH；105ml濃硫酸溶于  水中稀釋至10升。      樣品液：0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。      顯色劑：顯色劑列出兩種可任選一種。      顯色劑（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。      10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0.85 ml TiCL3（15%）      顯色劑（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。      0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀釋至250ml      A、將1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）濃度的溶液。      B、將2.5ml 0.01M KCN溶液與125ml乙醇甲醚混合。將A和B合并置棕色瓶中過夜即可使用。此溶劑用時，A、B兩溶液在前一天合并，配好的溶液僅能在1-2天內(nèi)使用，過時失效須重配。  五、方法與步驟：      1、樹脂的處理：      關(guān)于市售新樹脂的處理見7、，本實驗采用處理好的樹脂。      2、裝柱：將層析柱垂直裝好，關(guān)閉柱底出口，在柱內(nèi)注入約1cm高的檸檬酸緩沖液。  將經(jīng)處理已成鈉型的樹脂置于燒杯中，加進(jìn)1倍體積的檸檬酸緩沖液，攪成懸浮狀沿柱內(nèi)壁細(xì)心地把柱灌滿。倒時不要太快，以免產(chǎn)生泡沫。待樹脂在柱底逐漸沉積至約1cm高時，用吸管吸去柱內(nèi)上層所出現(xiàn)的清液，慢慢打開柱底出口，繼續(xù)加注樹脂懸液直至柱體裝到8cm高度為止。  在裝柱時要避免使柱內(nèi)液體流干而使裝柱失敗，另外樹脂懸浮液的溫度要相對恒定（特別是于采用高溫法）。裝好的柱體應(yīng)該沒有紋路，沒有節(jié)痕，沒有氣泡，柱頂表面平整而均勻。如此，方可投入使用，否則須要重裝。      3、平衡：  柱裝好后接上調(diào)好流速的恒流泵或恒壓洗脫瓶，用檸檬酸緩沖洗脫液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的PH與洗脫液的PH相同為止，這大約需要2-3倍床體積。      4、加樣與洗脫：  移去柱上加液器塞，打開柱底出口，小心使柱內(nèi)液體流至體表面時即行關(guān)閉。用加樣吸管吸取0.5ml氨基酸酸混合樣品溶液。沿柱壁小心地加入柱中，加樣不要過快，以免沖壞樹脂表面，加樣后慢慢打開柱底閥，使液面再與樹脂面相齊時關(guān)閉，然后再用吸管吸取適量洗脫液，如此清洗柱內(nèi)壁四周2-3次。洗滌后，用緩沖液在柱內(nèi)加至2-3cm高的液層，然后接上加液器，調(diào)好流速（24ml/hr）即開始洗脫。  注意在調(diào)節(jié)流速時要排除掉恒流泵或恒壓瓶與柱之間連接管內(nèi)的所有氣泡。并且在調(diào)節(jié)時不要過猛，以免影響層析行為。     5、收集：柱流液可用自部分收集器約收20管。     6、測定：  將收集的各管編號后，分別取0.5ml收集液于一潔凈的干試管中，加入1ml洗脫緩沖液；0.5mlKCN茚三酮試劑，混合后在100℃水浴加熱25分鐘，然后水冷卻5-10分鐘，加3ml 60%乙醇稀釋，搖勻后用72型或721型分光光度計在570nm處比色。  測定后，以光吸收為縱坐標(biāo)，收集的管數(shù)或ml數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。     7、再生：  對于裝好的柱使用幾次后需要0.2N NaOH溶液洗脫，再用蒸餾水洗至中性后重復(fù)使用。  對于市售的干樹脂其處理方法為：先經(jīng)水充分溶張后，傾泌去除細(xì)粒并使水澄清。然后經(jīng)浮選得到顆粒大小合適的樹脂，浮先后用4倍量的2N HCL和2N NaOH依次浸洗，每次半小時，換酸或堿時要用水將樹脂洗至中性，最后樹脂應(yīng)處理至溶液無黃色。這時再用1N NaOH使樹脂轉(zhuǎn)成鈉型（對于基它的轉(zhuǎn)型要視實驗和樹脂的情形而定），以蒸餾水洗至中性備用。  對于不知或難以估計層析行為的樣品層析時，要采用逐管收集測定跟蹤法，以便掌握層析的結(jié)果。  氨基酸測定一般在1PH左右，在本實驗中因緩沖液的PH就為5.3，因此可直接測定。但如果PH偏差要求太大，則可以加1ml、2N，PH5.5醋酸緩沖液，以保證測定條件。